一、實驗目的

   1.學習紫外分光光度計測定蛋白質含量的原理。

   2.掌握紫外分光光度法測定蛋白質含量的實驗技術。

   3.掌握TU-1901紫外-可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構造。

二、實驗原理

    1.紫外-可見分光光度計，是以溶液中物質的分子或離子對紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎而建立起來的一類分析方法。

紫外光：10-400 nm

可見光：400-780 nm（可被人們的眼睛所感覺）

特點：帶光譜、分子光譜

應用：定性分析-zui大吸收波長；

      定量分析-朗伯-比爾定律（標準曲線法和標準加入法）

a.定性分析原理：

  吸收曲線：吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀.

  b.定量分析原理：

    根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質的吸光度A與該物質的濃度c成正比。

    定量分析常用的方法是標準曲線法即只要繪出以吸光度A為縱坐標，濃度c為橫坐標的標準曲線，測出試液的吸光度，就可以由標準曲線查得對應的濃度值，即未知樣的含量。

c.儀器組成部件:

    各種類型的紫外-可見分光光度計，如下圖所示，從總體上來說是由五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示記錄裝置。

   2.本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質含量的實驗原理：

（1）蛋白質可作定量分析的原因：蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質溶液在275--280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質溶液在zui大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

（2）此種方法測量的準確度差一點的原因：由于不同蛋白質中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質及蛋白質亞基在280nm的吸光度在0.3—3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測量的準確度差一點。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經(jīng)驗公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質，在280nm處來測量蛋白質含量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強，但蛋白質卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算：

               蛋白質濃度（mg/mL）=1.4280-0.74A260

    （A280和A260分別為蛋白質溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值）

        還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質的含量：

               蛋白質濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

 其中A280為蛋白質溶液在280nm處測得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子

（4）稀溶液中蛋白質濃度測定的經(jīng)驗公式：蛋白質的肽鍵在200—250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質濃度測定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗公式：

                蛋白質濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分別為蛋白質溶液在215nm和225nm處測得的吸光度值

三、儀器與試劑

    儀器：TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管（10ml的5個），吸量管。

試劑：標準蛋白質溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測蛋白質溶液（牛血清白蛋白）。

四、實驗步驟

   1.基本操作

    （1）啟動計算機，打開主機電源開關，啟動工作站并初始化儀器,預熱半小時。

    （2）用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL標準蛋白質溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比（參比溶液不可取出）.

    （3）在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描，設置掃描參數(shù)（起點：400nm，終點：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描）

    （4）將兩個均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測量池中，進行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調(diào)回光譜掃描。

2.吸收曲線的制作:（找出zui大吸收波長）

     將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質溶液，點擊START進行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標準蛋白質溶液的zui大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為0.1984。

   3.標準曲線的制作：

     在工作界面上選擇測量項目為光度測量設置測量條件（測量波長：278.00 nm）。

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在278nm處分別測定以上所配標準溶液的吸光度A278，記錄如下：

濃度（mg/mL）
 

0.3
 

0.4
 

0.5
 

0.6
 

0.7
 
 

A278
 

0.1971
 

0.2532
 

0.3222
 

0.3758
 

0.4382
 

 以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線：

    4.樣品測定：

      配制三份待測蛋白質溶液，（取待測蛋白質溶液2.0mL分別于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出待測蛋白質的濃度為0.6101mg/mL。轉換后待測蛋白質溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。

五、注意事項

準備工作：

（1）在測量前應把機器預熱半小時。

（2）溶液一定要配制準確,以防影響實驗效果,保證點在一條直線上。

（3）由于蛋白質的紫外吸收峰常因PH值的改變而改變，故進行樣品測定時的PH與標準曲線制作時的PH值一致。

測量工作：

（1）吸收曲線繪制前必須進行光譜的掃描。

（2）.在作標準曲線進行定量前一定要選擇zui大的吸收波長,確保靈敏度高。

（3）在實際操作中，比色皿在使用中應注意保持干凈，更不能觸摸比色皿的光面，以防摩擦影響通光。

六、思考題

1. 紫外分光光度法測定蛋白質的方法有何缺點及優(yōu)點？受哪些因素的影響和限制？

答：優(yōu)點：方法操作簡便、迅速、不需要復雜和昂貴的設備，不消耗樣品，測定后仍能回收使用，低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶液不干擾測定。

    缺點：準確度和靈敏度差一點。干擾物質多：對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會產(chǎn)生較大干擾

2. 若樣品中含有核酸類雜質，應如何校正？

 答：因為核酸在260nm處的光吸收比280nm更強，但蛋白質卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算：

          蛋白質濃度（mg/mL）=1.4280-0.74A260

  （A280和A260分別為蛋白質溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值）

  還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質的含量：

             蛋白質濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d